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“PCR”一词最早在1983年由美国科学家Mary Mullis提出，PCR即聚合酶链式反应 ( polymerase chain reaction，PCR) ，其核心是在体外提取DNA分子后，以DNA分子为模板，在引物和DNA聚合酶的作用下，通过碱基互补配对和半保留复制原理，以“变性-退火-延伸”三个基本反应步骤为一个循环，经过几十次循环使基因放大数百万倍，以达到富集靶标基因的目的。PCR已发展成为分子生物学领域的一项关键和常规技术， PCR扩增产物可用于下游多种应用，如基因克隆、表达分析、芯片杂交、突变检测、测序等，极大地推动了生命科学各个领域的发展。

长江后浪推前浪，随着科学技术的发展，PCR技术从诞生至今，经过了三代更迭。

1）普通PCR（Polymerase Chain Reaction）。早期对PCR扩增产物进行分析的时候，只能采用琼脂糖凝胶电泳的方式。由于技术的局限性，我们只能通过观察条带的大小、数量等进行定性分析，而且实验操作繁琐，实验过程容易引起交叉污染。然而随着科学家们对分子领域的深入研究，凝胶电泳等定性分析技术已经无法满足对基因片段进行精确定量研究的要求。

为了解决上述问题，第二代实时荧光定量PCR技术开始出现。

2）实时荧光定量PCR( Quantitative Real-time PCR，qPCR)即在PCR反应体系中加入荧光基团（染料或者荧光探针），利用荧光信号的变化实时检测PCR反应过程中每一个循环的荧光变化，最后生成扩增曲线，借助荧光曲线的Ct值和标准曲线来定量起始靶基因的浓度。

荧光定量PCR常用的荧光标记方法有两种，一种是非特异性荧光标记的染料法，如SYBR Green、EvaGreen等；还有一种是特异性荧光标记的荧光探针法，TaqMan。对于染料法只要在扩增过程中有双链DNA产生，SYBR Green就会不断的结合到双链DNA的小沟部位，存在非特异性扩增的问题。而探针法只有当扩增产物的序列与探针完全匹配时才能产生荧光信号，因而保持了极高的检测特异性。

虽然荧光定量PCR具有操作便捷、通量高、检测成本低等优势，但是在经过一段时间的实验研究后发现，因为受扩增效率的影响，qPCR定量分析的基础循环阈值（Ct值）不是恒定不变的，导致其重现性和灵敏度不高，无法满足分子生物学绝对定量分析的要求。所以新的分子生物检测技术势在必行！至此，第三代数字PCR技术走上舞台。

3）数字PCR(digital PCR，dPCR)的中心思想是通过分区扩增后检测所有反应单元中的荧光信号，利用数学模型矫正直接计算出目标靶分子的浓度或拷贝数（详见下文）。因而可以无需对照标准样品和标准曲线，不依赖于Ct值来实现绝对定量分析。

简而言之，数字PCR（Digital PCR，dPCR）是继第一代、第二代PCR技术之后，这几年才迅速发展起来的一种核酸绝对定量技术。作为一种全新的核酸检测方法，数字PCR解决了qPCR需要依赖标准曲线来定量分析的问题。通过终点检测法，可以直接数出目标DNA分子的个数，实现“单分子模板扩增”的绝对定量，极大提高了检测灵敏度。可以说数字PCR是目前检测灵敏度最高的核酸检测手段了。那么它是如何实现高灵敏度和绝对定量的呢？

数字PCR与荧光定量PCR最大的不同点之一就是反应体系的再分配。将一个样本平均分配到上万个反应单元，使每个反应单元中的DNA都单独进行扩增，利用荧光探针或者染料法检测特定的靶序列，扩增结束后对各反应单元的荧光信号统计分析。

(1)

为了方便理解，我们可以把数字PCR检测又双叒叕分为三个步骤。

第一步，有限稀释，为了实现单分子模板扩增，将稀释后含有靶分子的PCR反应体系分割成大量微小的反应单元，使每个微小单元中包含零个、一个或多个靶分子。

第二步，扩增反应，每个微小单元进行独立的PCR扩增。

第三步，检测分析，扩增结束后检测各个反应单元的荧光信号，然后根据泊松分布原理统计分析阴性反应的个数和比例，直接计算得出待测靶分子的浓度或拷贝数。

数字PCR基本原理

那么为什么需要用泊松分布校正统计呢？请看下图：

因为理论上，也就是在理想情况下，DNA分子都是平均分配到各反应单元中的，检测的时候有荧光信号的就可直接判读为目标DNA分子的拷贝数。但是，实际操作中，在分配的时候目标DNA分子都是随机分布的，数字PCR的反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子，正是这种概率情况的发生，所以这个时候就需要采用泊松分布的概率公式 (Poisson distribution)进行计算：

数字PCR高精确度除了和它前期样本分散有关外，另一个重要原因也就是在数字PCR检测分析中引入了泊松统计。因为目标分子的离散是具有随机性的，如果直接进行检测，其浓度结果是不准确的。所以我们可以根据反应单元数目和其中阴性比例，即可通过泊松分布统计获得初始浓度。   

（2）

数字PCR高精确度除了和它前期样本分散有关外，另一个重要原因也就是在数字PCR检测分析中引入了泊松统计。因为目标分子的离散是具有随机性的，如果直接进行检测，其浓度结果是不准确的。所以我们可以根据反应单元数目和其中阴性比例，即可通过泊松分布计获得初始浓度。

根据样品分液方式的不同，我们将数字PCR分为两大类： 微阵列芯片式数字PCR(Chip digital PCR，cdPCR) 和液滴式数字PCR(Dropletdigital PCR，ddPCR) 。

微阵列芯片式PCR主要通过芯片设计，在芯片上蚀刻有上万个相同体积的微孔方阵，将纳升液体封闭在高通量的微池或微量通道中进行后续的PCR扩增及扩增后结果直接判读。

液滴式数字PCR主要是设计带有微流道通道和反应腔室的芯片，在反应腔室内通过油水两相间隔得到成千上万个微小液滴，PCR扩增后通过统计液滴的荧光信号计算目标基因的拷贝数。这种以单个油包水液滴为单位的 PCR 反应体系，更容易实现小体积和高通量，而且系统简单，成本低，因此成为理想的数字PCR技术平台。

介绍了那么多，我们的“流量小鲜肉”数字PCR，到底有哪些优势呢？

（3）

1.绝对定量：无需标准品(标准曲线)，直接分析判读出目标分子拷贝数；

2.高灵敏度：可实现单分子检测，检测限低至0.001%，可以克服高背景干扰，实现目标DNA/RNA的富集，直接检测出痕量核酸模板量；

dPCR可以实现痕量核酸的高灵敏检测

3.高耐受性和重复性：适合基质复杂样品的检测（如血液样本、粪便、尿液、体液、水、土壤等样品），将样品分散到大量独立的反应室中进行扩增，不依赖于扩增效率，使检测具有重复性，终点PCR检测，能克服PCR抑制剂的影响；

4.高定量精确度：数字PCR将一个传统PCR反应变成数万个PCR反应，分别检测这些独立的反应单元中的目的序列，能够有效区分微小的浓度差异，大大提高了检测灵敏度和准确性。可以用于精确测定靶基因的相对表达，基因拷贝数变异分析等。

近年来数字PCR技术取得了飞跃式的发展，鉴于数字PCR技术具有独特的绝对定量优势，其应用领域也在不断的扩大，可广泛应用于肿瘤液体活检（早筛、用药指导、伴随诊断）、无创产前检测、病原微生物检测、食品安全检测、遗传疾病诊断、移植排斥监控、肠道菌群分析、药物基因组检测、基因表达分析、环境检测和分子生态、农业和动植物检测等多个领域。可以说数字PCR是一个拥有巨大潜力的新兴技术。

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注：部分数据引自《数字PCR—原理、技术及应用》一书。

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